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FFPE 人肺癌 Stereo-seq 5' 空间转录组双分辨率分析报告（修订版 v2 · 含空间剪接）

研究目标：通过 bin50 + cellbin 双分辨率架构 + PE200 空间可变剪接，结合临床病理背景，解析肺癌空间免疫微环境与剪接异质性
任务：FFPE 人肺癌 Stereo-seq 5' 空间转录组双分辨率分析报告（修订版 v2 · 含空间剪接）

摘要

对 FFPE 人肺癌双芯片 (Y40455A8/AC, 61 岁女性早期惰性 LUAD) Stereo-seq 5' 数据完成双分辨率分析 (bin50 190,291 bins + cellbin 317,588 cells→36,649 meta-cells)，并利用 PE200 长读优势新增空间可变剪接检测。核心发现：CD8 肿瘤内减少/EMT 界面富集的免疫排斥空间结构（细胞级验证）、TLS 生态位（15+14 结构）、EGFR-EMT 驱动免疫排斥轴（TCGA 双队列验证）、TPM1/CD44 空间剪接方向性信号。方法学注意：区域级免疫签名含细胞组成混杂（HLA-I 一例已去卷积复核修正）。

引言与背景

临床病理背景（样本锚点）

样本为 61 岁女性右中肺叶浸润性腺癌（病理号 2420427，早期惰性 LUAD）。⚠️ 本报告含真实患者临床信息，内部使用；外发/演示前需脱敏（隐去病理号与淋巴结明细）。

项目结果
患者女, 61 岁, 右中肺叶
大体单发 2.8×2×1.5 cm, 切缘阴性
病理诊断浸润性腺癌, 中分化 (腺泡型为主)
IHCTTF-1(+)/Napsin-A(+)/CK7(+)/EMA(+); P53 弱(+); Ki67 5%
排除P40/CK5/6/P63(−); ALK(D5F3)(−)
浸润评估脉管/神经/STAS 均(−)
淋巴结0/11 全阴 (预后良好)
临床意义早期惰性 LUAD

科学问题

5 个未解问题: Q1 边界免疫排斥梯度; Q2 TLS 耐药悖论; Q3 驱动轴+5' TSS/剪接; Q4 空间受限靶点; Q5 NETosis-TLS。双分辨率架构 + PE200 全长转录本提供 cross-resolution 互证与空间剪接能力。

研究方案与方法

方法与数据

结果

结果

结果 1: 空间全貌与细胞组成

bin50 190,291 bins (AC 106,425 + A8 83,866)。cellbin 317,588 细胞 → 36,649 meta-cells: Tumor 53% / Stroma 23.5% / Immune 23.5%。

bin50 AC 域注释空间 QC
bin50 AC 域注释空间 QC

cellbin A8 domain + HLA-I
cellbin A8 domain + HLA-I

解读: 与病理「腺泡型中分化腺癌」一致, 肿瘤域致密; 免疫域浸润于界面。

结果 2: 肿瘤-免疫界面免疫排斥（细胞级去卷积复核后稳健结论）

原「HLA-I 免疫编辑梯度」经复核修正: bin50 免疫区 HLA-I loss 组件较高 (免疫 0.144>基质 0.140>肿瘤 0.116), 但细胞级去卷积 (仅肿瘤上皮 EPCAM/KRT8+ 细胞, 排除免疫细胞) 显示近免疫肿瘤 HLA-I 反而更高 (AC: 50-100μm=0.037 → >200μm=0.018), 与免疫编辑下调方向相反 → bin50 现象主要为免疫细胞组成效应, 不做强因果 claim。

稳健结论: CD8 肿瘤内显著减少 (cellbin in/out p=3e-20)、EMT 界面富集 (p=1e-222) — 免疫排斥空间结构成立。

bin50 免疫排斥梯度曲线
bin50 免疫排斥梯度曲线

cellbin AC domain + HLA-I (去卷积复核)
cellbin AC domain + HLA-I (去卷积复核)

结果 3: TLS 结构 (bin50 15 / cellbin 14)

成熟 TLS (GC+Tfh+HEV) HEV 显著升高 (p=0.023); 邻域 300-800μm 免疫信号升高 (p=0.042, 注意组成效应, 表述为「邻域免疫细胞相关信号升高」)。

bin50 TLS 空间图 (AC)
bin50 TLS 空间图 (AC)

cellbin TLS (AC)
cellbin TLS (AC)

结果 4: 驱动基因空间轴 (bin50 + cellbin 互证)

肿瘤内驱动×免疫负相关: bin50 (ROS1 q=1e-129, EGFR q=1e-80), cellbin (ROS1 q=8e-16, EGFR q=5e-8)。

EGFR 表达空间图
EGFR 表达空间图

驱动×免疫散点
驱动×免疫散点

结果 5: TCGA 桥接 (513 LUAD + 498 LUSC)

EGFR 高表达组 ImmuneScore↓ (LUAD p=0.0036, LUSC p=8e-5), EMT↑ — 与空间免疫排斥结构互证。

TCGA EGFR 免疫评分
TCGA EGFR 免疫评分

结果 6 (新增): PE200 空间可变剪接

利用 BAM junction reads (总 3.38% spliced; TPM1 9.45%/CD44 5.86% 剪接率高) 完成 12 靶基因空间剪接: 27,504 junction reads (L01+L02 AC + L03 A8; L04 CID 编码异常跳过) 映射空间坐标, 533 区域 ψ 计算。

M9: 优势 junction 使用率按空间域
M9: 优势 junction 使用率按空间域

M9: TPM1/CD44 junction 空间密度
M9: TPM1/CD44 junction 空间密度

解读: TPM1 优势 junction ψ_tumor=0.259 vs ψ_immune=0.308 (p=0.069) — 肿瘤区 TPM1 剪接比例下降趋势; VIM (0.375 vs 0.393)、PKM (0.155 vs 0.111) 有方向性差异。FFPE 5' 表达稀疏限制统计效力, 但证明 PE200 空间剪接可行且信号方向与肿瘤生物学一致。技术方案 (索引+fetch+向量化) 每 lane 仅 40s。

结果 7 (新增): cellbin 谱系与数据限制

meta-cell 谱系空间分布: Epithelial_Tumor 11,866 / T_cell 8,813 / Fibroblast 5,157 / B_plasma 4,396 / NK 3,417 / Myeloid 1,002 / Endothelial 865 / Mast 726 / Prolif 407。

M10: cellbin 谱系空间分布 (AC)
M10: cellbin 谱系空间分布 (AC)

解读: 肿瘤上皮主导组织与腺泡型病理一致。FFPE 5' 免疫转录本捕获极低 (CD3D 0.005%/CD8A 0.009% 细胞级), 稀有免疫亚群原理上不可靠检出 — 如实记录, 不强行推断。

讨论

讨论

1. 双分辨率 (bin50/cellbin) + TCGA 三方互证的框架: 免疫排斥空间结构、TLS 生态位、驱动-免疫轴

2. 方法学注意: 区域级免疫签名易受细胞组成混杂 (HLA-I 一例经去卷积验证后修正) — 空间分析应尽量细胞级/去卷积验证

3. PE200 空间剪接首次落地: BAM 索引+fetch 方案高效 (40s/lane); TPM1 ψ 域间差异方向性提示肿瘤区剪接改变, 需更高深度验证

4. TLS 成熟度 (HEV/GC) 与耐药生态位: 需更多验证

5. 局限: 单样本 (同一患者双芯片); FFPE 5' 表达稀疏限制稀有免疫/剪接统计效力; 本流程内首次完成 FFPE 肺癌 5' PE200 双分辨率+剪接重建 (不宣称领域「首个」)

6. 病理-空间互读: 惰性病程 (淋巴结 0/11 阴) 伴免疫排斥结构 + 成熟 TLS, 与低侵袭生物学一致

参考文献

1. TLS signatures are associated with survival and immunotherapy response in LUAD. Immunologic Research. 2025;73(1):40. doi:10.1007/s12026-025-09595-9

2. Single-cell spatial analysis identifies ID1-high endothelial cells in TLS as predictors of durable response to immunotherapy in NSCLC. Cancer Cell Int. 2025. doi:10.1186/s12935-025-04161-7

3. Machine learning identifies TIME subtypes linking EGFR mutations and immune states in LUAD. npj Digital Medicine. 2025. doi:10.1038/s41746-025-02172-2

4. 病理报告: 病理号 2420427 (内部)