使用PRIME ASSEMBLY进行靶向基因组整合和重排

科学问题

人类遗传病突变形式复杂多样，往往需要大片段编码区替换。然而，传统同源定向修复高度受限于细胞周期的S/G2期，且核酸酶介导的双链断裂易诱发染色体重排与脱靶毒性；现有引导编辑又仅能插入不足250 bp的短片段。本研究旨在探索能否借鉴体外分子克隆组装机制，在避免双链断裂的前提下，利用双向单链DNA瓣直接在细胞内组装并整合中大片段序列。

背景与领域脉络

基因治疗亟需在特定位点实现中大片段DNA的精准置换，但现有技术路线瓶颈明显。依赖CRISPR核酸酶的同源定向修复（HDR）仅在分裂期细胞中活跃，在静息造血干细胞中效率低下，且双链断裂会诱发染色体易位。引导编辑虽具极高保真度，却受限于逆转录酶的延伸能力；重组酶介导的敲入技术则依赖复杂的两步递送，且双链供体易激活宿主免疫反应。受细菌非重组酶依赖重组机制与体外吉布森组装的启发，作者设想通过双引导编辑合成互补的单链DNA瓣。这使得外源供体能够借助细胞内源酶系，在无双链断裂的状态下完成原位同源退火与修复缝合。

方法与技术路线

实验主要在K562、HEK293T、Jurkat细胞系以及人原代CD3+ T细胞和CD34+造血干祖细胞中开展。团队通过电转递送PEmax或PE7引导编辑蛋白，并设计成对表达的工程化pegRNA，在靶位点引导生成互补的3'单链DNA瓣。供体采用末端硫代磷酸酯修饰的单链DNA，或经λ外切酶消化的双链DNA，尺寸跨越106 bp至12.1 kb。通过靶向扩增子高通量测序、微滴式数字PCR（ddPCR）及流式细胞术定量分析编辑效率与产物纯度。此外，作者开发了基于外源片段诱饵引物单向扩增的Donor-seq技术，在全基因组水平无偏检测整合特异性，并利用DNA-PK抑制剂AZD7648与Polθ抑制剂PolQi1调控DNA修复途径。

主要结果

创新点

与依赖核酸酶切断双链的传统同源定向修复（HDR）相比，PA利用成对引导RNA直接催化合成单链悬垂末端，彻底规避了双链断裂诱发的染色体断裂与复杂易位风险。相较于双引导编辑（TwinPE）或依赖着陆点重组酶的两步法，PA首次实现了单步骤原位敲入中大片段外源供体，不仅支持多达4个DNA片段的细胞内组装，而且兼容低免疫原性的单链DNA供体，打破了以往大片段敲入对AAV载体或双链DNA供体的绝对依赖。

意义与影响

该技术填补了精准基因组编辑中大片段无双链断裂敲入的空白。由于其修复过程不依赖细胞周期的S/G2期重组机制，PA在分裂期与非分裂期细胞中展现出相当的编辑活性，成功拓宽了原代造血干祖细胞等静息细胞的改造途径。此外，多片段组装特性化解了体外合成超长DNA片段的递送难题，为通用型CAR-T细胞构建、造血干细胞基因缺陷的全外显子原位重构提供了安全通用的底层工程化方案。

局限与待验证

在未添加小分子抑制剂时，PA存在瓣状末端不完整敲入伴随微小缺失等竞争性非精准副产物，临床转化中对DNA-PK及Polθ抑制剂的依赖增加了化学毒性与质控难度。其次，随着供体分子量扩大至10 kb以上，整合效率衰减迅速。此外，本研究主要聚焦于离体细胞电转，在体内组织递送双pegRNA体系及长链供体时的编辑效率与长期安全性仍有待深入评估。

对我们的相关性

对从事基因治疗与细胞工程的研究者，PA提供了一种无需病毒载体且无需DSB的安全整合策略，在制备CAR-T或报告细胞株时，可将复杂转基因拆分为2至4个片段直接电转组装，极大规避大质粒合成困难。对单细胞及空间多组学研究者，该方法支持将长条形码或组合多色荧光标记精准定点敲入特定内源基因座。生物信息学与AI研究者则可针对双单链瓣退火动力学，开发成对pegRNA特异性预测与靶向效率优化的全新算法模型。

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