Olink PEA（Proximity Extension Assay）的核心是"双识别 + 邻近延伸"：两个独立探针结合同一蛋白的不同表位，探针上连着的 oligo 因邻近而互补延伸，产生可定量的 DNA 信号。识别分子不必须是抗体——SomaLogic 用核酸适配体（SOMAmer）已证明"非抗体邻近检测"能做成 11000-plex 商业平台。
给定蛋白质的活性位点，可以预测特定的短肽与该位点结合。如果设计两个临近活性位点的亲和性短肽，短肽尾端通过 OPO 结构修饰连上 oligo，即可实现类似 PEA 的方法（Olink 抗体方案）——以短肽替代抗体，实现更高通量的理性设计血浆蛋白质组。
针对靶蛋白活性位点 + 邻近位点，生成两段亲和短肽
mRNA 展示大规模筛选，获得 nM 级亲和 hits
短肽双端连 oligo（1:1 化学计量，单一分子实体）
两短肽结合同一蛋白 → oligo 邻近 → 延伸
延伸产物 qPCR/NGS 定量 → 绝对定量蛋白浓度
短肽的读出问题由已发表的纳米孔蛋白质测序方案解决——Oligo-Peptide-Oligo（OPO）三明治结构（Nature Communications 2026）：短肽双端各偶联一条寡核苷酸，形成"oligo-肽-oligo"单一分子实体。
1:1:1 化学计量确定——LysC 酶切（C 端赖氨酸）→ FSO₂N₃ 温和叠氮化（室温 30 min，不伤肽）→ DNA 模板化点击偶联（DTC：双 DBCO-oligo 退火到含 AP 位点的互补链，模板预组织反应物）。短肽双端都可以结合 oligo，不存在化学偶联的比例不均一问题 → 每个探针都是单一分子实体 → 可做绝对定量。已在 50+ 肽段验证偶联高效，读出丰度与亲和力正相关（SPR 交叉验证）。
合成短肽，保留伯胺（N/C 端）
FSO₂N₃ 温和重氮转移，室温 30 min
双 DBCO-oligo + AP 位点模板，点击化学 1:1:1
磁珠纯化去除副产物
双 oligo 分别作引物段/延伸段（PEA 设计）
C 端缺赖氨酸的肽段、N-乙酰化/赖氨酸修饰（PTM）会失败；N 端脯氨酸无产物；多 N 端酪氨酸产率低。AI 设计短肽时须约束"保留至少一个伯胺 + 避开上述序列"。
亲和力是短肽方案的核心关隘。解决方式不是赌 AI 单点命中，而是AI 生成候选池 + mRNA 展示大规模混合表达 + 亲和淘选富集，把"设计效率 × 筛选通量"同时提上来。
每靶点 10⁴-10⁶ 条定向设计序列（含 OPO 序列约束）
无细胞大规模翻译，库容量 10¹³（远超噬菌体展示 10⁹-10¹¹）
固定化靶蛋白，多靶点并行（分孔/分珠），多轮富集
hits 序列直接读出 → 回流训练 AI 模型（迭代闭环）
SPR 亲和力 + 特异性 → OPO 偶联 → PEA 探针
内置半胱氨酸 + 化学环化 → 一步获得刚性环肽：亲和力提升 10-1000×、抗蛋白酶降解、代谢稳定性好。mRNA 展示出 nM 级环肽 binder 已有成熟先例。
淘选结果是最真实的训练标签：hits 序列 + 亲和力数据回流 AI 生成模型，下一轮候选池更准——"AI 越用越懂靶点"。
肽长下限约 15 aa（<10 aa 效率下降）；无细胞表达无折叠伴侣/二硫键优化（线性/环肽 binder 通常不依赖）；标准库限天然 20 种氨基酸（RaPID 可经 tRNA 工程掺入非天然残基，能力扩展项）。
| 维度 | 短肽双探针（本方案） | Olink 抗体 PEA |
|---|---|---|
| 识别分子 | AI 设计 + mRNA 展示淘选短肽 | 抗体对（杂交瘤/噬菌体展示） |
| 开发周期 | 数周/靶点，批量并行 | 6-18 月/对 |
| 探针结构 | OPO 三明治：oligo-肽-oligo，1:1 化学计量 | 抗体-SMCC-随机偶联 oligo |
| 定量性质 | 单一分子实体 → 绝对定量 | 偶联比例批间波动 → 相对定量 |
| 批间一致性 | 化学合成，批次几乎无漂移 | 抗体批次差异是行业痛点 |
| 空间适配 | 短肽小（<2 kDa），双位点可很近，天然适配邻近延伸 | 抗体大（150 kDa），表位间距受限 |
OPO 解决"怎么读"，不解决"能不能结合"——线性短肽对蛋白界面 Kd 多在 μM 级；PEA 达 fM 级蛋白检测灵敏度需探针 nM 级。双短肽邻近共结合概率 ∝ 两个 Kd 的乘积，μM×μM 会让信号/背景比崩塌。靠环肽化 + mRNA 展示淘选 + 亲和力成熟迭代解决。
每个蛋白需要"两个邻近且空间方向正确"的结合位点（oligo 末端间距 <30 nm 且利于延伸）。活性位点通常只有一个——部分靶点不可得，导致覆盖不全。
短肽结合界面小，同源家族（MMP/激酶/细胞因子家族）交叉反应风险高；血浆高丰度蛋白（白蛋白+IgG+转铁蛋白占 90%+）背景干扰大。抗体对的双重识别是特异性主保障，短肽对的叠加特异性需实验证明。
OPO 双 oligo 原为纳米孔马达拉动设计，非为邻近延伸设计——延伸效率、非特异延伸背景需重新表征。
| 阶段 | 目标 | 关键产出 / Kill 标准 |
|---|---|---|
| P0复用已发表系统（1-2月） | 用 NC 2026 已验证的 C-peptide/FLAG OPO 肽段，把双 oligo 改造成 PEA 探针，重组蛋白梯度稀释测延伸信号线性 | LOD 测定。Kill：LOD > 100 ng/mL 或 Kd > 1 μM |
| P0.5亲和力关（2-3月） | 3-5 真实靶点（CRP/IL-6 + 1 皮肤靶点）AI 设计 + mRNA 展示淘选，SPR 测 Kd | 筛出 >100 nM 短肽对进入 P1 |
| P1血浆基质（3-6月） | 掺标回收率、同源家族交叉反应（IL-6 vs IL-11 vs IL-6R）、50 例血浆对照 Olink/质谱 | R² 与 CV 达标 |
| P2规模预演（6-12月） | 20-50 靶点 panel（高/中/低丰度），100+ 样本对照 Olink Explore HT | 端到端周期与成本对比、平台品牌 |
| P3规模化（12月+） | 流水线常态化：年度批量产出 candidate，对外合作/授权 | 持续管线供给 |
OPO 的"绝对定量"属性可直接走纳米孔读出，绕开 PEA 的延伸效率问题：短肽探针（带 pull-down 标签）抓血浆蛋白 → 洗脱 → LysC 酶切 → OPO 文库 → 纳米孔指纹定量。论文中 3 蛋白盲测 96.3% 已证明闭环可行，且"reads 丰度 ∝ 亲和力"是现成的定量基础。缺点：丢构象信息、灵敏度受洗脱效率限制。两条线共用同一套"AI 短肽设计 + OPO 偶联"平台，PEA 打灵敏度上限，纳米孔打绝对定量。
替代 Olink 抗体方案 · 实现血浆蛋白质组 · 从相对定量走向绝对定量